全面抗战爆发，周至柔指挥国民党空军参战。抗战中，国民党空军曾派出飞机两架，远飞日本本土长崎、福冈、久留米、佐贺、九州各地，散发告日本国民党和告日本外交协会书等传单、小册子共14万份，震惊了海内外。
1937年7月7日，抗日战争正式爆发。不久，航空委员会正式成立空军作战前敌总指挥部，周至柔兼任总指挥，毛邦初为副总指挥，石邦藩任参谋长，并正式下达抗战动员令。当时，空军作战部队共十个大队，共有各型飞机305架。
8月5日，第二大队进驻信阳，警戒中原，相机对上海作战;第三大队进驻句容，警卫南京;第五大队进驻江都，对津浦路与上海作监视作战;第四大队进住周家口，监视中原;第九大队进驻信阳，相机进驻蚌埠，支援地面部队作战。
日军为达到全面侵华的目的，在进攻华北同时，重兵向华东地区发动进攻。为此，日本海军航空队在台湾等地布置许多远程轰炸机和战斗机，对中国军队构成严重威胁。周至柔奉命立即改变原作战计划，将空军力量全部转至京、沪、杭地区，阻止日军在上海登陆，以策应南京之安全。
8月13日，上海抗战正式打响。航委会立刻举行紧急作战会议，周至柔决定于次日凌晨派第五大队挂五百磅大炸弹飞往上海，轰炸长江里的日本第三舰队;同时令第二大队飞往上海，分别轰炸江上日本舰队及汇山码头登陆日军与码头库房。这时，在周家口的第四大队大队长高志航突然来到，要求参战。他即命令高志航率队火速赶到杭州笕桥机场。
这时长江下游地区大雨滂沱，对空军行动极为不利。为了掌握战机，周至柔要各飞行队按原计划执行。四大队冒雨从周家口飞往笕桥，刚着陆便遇空袭警报。高志航率领队长郑少愚、李桂丹两机群共27架，紧急升空作战，分途拦截敌机。奋战结果，击落三架，首创空战之光荣纪录。这一消息，经各地电台、报纸报道，立即传遍全国。许多城市大放鞭炮，庆祝胜利。周至柔更是兴奋不已，发表演说，勉励空军发扬英勇战斗精神，再接再厉。当时许多外国记者不相信中国空军能击落日机，他亲自带记者们去看日机残骸。后来，国民党政府决定将这一天定为“空军节”。
8月15日，敌机六十余架分批轰炸南京、杭州、嘉兴、曹娥等机场，周至柔下令奋起还击。第九大队在曹娥上空击落敌机4架，第四大队在杭州上空击落敌机16架，并协同第三、五大队及航校暂编部队在南京上空击落敌机14架。16日，第四、五、三各大队分别于杭州、句容、嘉兴、南京、扬州上空截击，共击落敌机8架，伤数架。号称日军精锐的鹿屋与木更津两海军航空联队几被歼灭。17日，空军又主动出击，轰炸上海敌军司令部及其虹桥阵地，给敌军很大打击，击落敌机两架。19日，第二大队龚颖澄、谢郁育率轰炸机，并由第四大队李桂丹率驱逐机6架为掩护，袭击在白龙港集结的航空母舰，结果炸沉巡洋舰一艘。
1938年春，航空委员会改组，钱大钧担任航委会主任，周至柔为委员兼主任参事。不久，中国自苏联购入一批飞机，力量稍有加强。在2月2日的南昌空战和4月11日的武汉空战中，与苏联空军合作，又取得较大的胜利。加上1937年9月21日的太原空战的结果，共击落敌机115架，并俘日空军“驱逐之王”三轮宽少佐。武汉保卫战，又炸伤敌舰67艘、击沉23艘。
5月19日，国民党空军派第十四队队长徐焕升率机二架，远飞日本本土长崎、福冈、久留米、佐贺、九州各地，进行政治宣传，并侦察日本机场及军港情况，该机携带告日本国民党和告日本外交协会书等传单、小册子共14万份。目的是唤醒日本军队与民众的觉悟，显示中国军队的实力。国外新闻界对此纷纷报道，称此举“胜于炸弹”，“使日之暴行置身无地”。
是年12月中旬，桂林行营命令所部向侵占昆仑关的日军发起总攻。空军以柳州、桂林为基地，派第四大队和苏联志愿大队到柳州，第五大队驻桂林，负责控制制空权，配合陆军行动。12月17日，周至柔在桂林用电话向柳州机场下达作战命令：“我陆军均已就了战斗发起线，明早八时半发起总攻，我们的飞机要在八时半以前到达昆仑关上空，掩护陆军作战。”
12月28日凌晨，中、苏两个大队的全部飞机在柳州机场试车、试枪完毕，准备起飞。由于柳州机场接到情报电话，日本重轰炸机分三批向柳州方向飞行，柳州飞机乃于7时15分提前起飞至昆仑关上空。一小时后，敌人轰炸机由桂林回来，周至柔亲自挑选的柳州空军地面指挥官刘毅夫命令立即对敌机进行拦截。结果，郑少愚等打下敌轰炸机6架。29日与30日，柳州空军又数度飞往昆仑关上空，支援地面部队作战，直至中国军队攻克昆仑关
1941年4月，空军总指挥部成立，专负作战训练之责，周至柔担任总指挥，其教育长之职交给毛邦初。6月，由美国购到P-40驱逐机100架，适美国陈纳德将军组织志愿队来中国，这些飞机即拨交其使用。此时，国民党空军作战部队仍为7个大队。
是年12月，在第三次长沙会战中，第二大队击落敌机1架、伤2架。1942年1月，国民党空军远征越南，轰炸日军在河内、菇林的机场，炸毁敌机几十架。
这年，周至柔随蒋介石访问了印度。
由于美国此时补充的新飞机渐次到达，周至柔筹划组织各大队分派人员赴美参加高级飞行员训练班，以及去印度卡拉奇接受美国办的初级飞行员训练班受训。至年底，这些受训人员共接收B-29轰炸机8架、P-40驱逐机27架、P-43驱逐机41架、P-66驱逐机82架，总共337架。1943年，国民党空军作战部队仍为7个大队，另有一个混合大队，决定采用机动集中原则，以打击敌人。
是年5月，在鄂西会战中，国民党空军分别轰炸了汉口、宜昌、沙市等机场，击落敌机41架、炸毁6架、伤敌舰23艘。随后，中美空军混合团加强合作，有效地协助陆军进行常德、豫西、长衡、桂柳等会战，共击落敌机216架、伤46架，击毁地面机149架，并炸毁敌军车400余辆、大小舰船近600艘。
同年，周圣柔随蒋出席了开罗会议。之后，他连续获得景星勋章和青天白日勋章。1945年5月，他当选为国民党六届中央执行委员，继任军事委员会委员长侍从室第一处主任。
这年8月，抗日战争胜利。10月，周至柔获得胜利勋章。这时，国民党空军有第一、二、三、四、五、八、十一等7个大队及第十二直属中队。年底又陆续接收美B-25、P-40、B-51等新式飞机，实力增强，装备、速度、性能均较优良，并操控了制空权。
周至柔病逝后，台北《中国时报》报道了这一消息，标题颇有意味：“叱咤疆场创始空军实至名归;纵横球场提倡围棋非公莫属”
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